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本试剂盒专为以RNA为模板（如RNA病毒）的荧光定量PCR检测而设计，是一种通用型灵敏度高且精密度高的RT-qPCR多重检测解决方案。逆转录和qPCR反应在同一管内完成，不需要额外的开盖和移液等操作，降低污染风险的同时，缩短了操作时间，有效解决了样本因操作时间久而产生降解的问题。本试剂盒中引入了dUTP/UDG防污染系统，热敏感UDG酶在室温条件下即可将含U的污染物迅速降解；55℃逆转录时，热敏感UDG酶迅速失活，不会影响整个反应的效率和灵敏度。经过优化的酶混液Mix，搭配扩增反应液Mix，使得AlVar One-step RT-qPCR Kit的检测灵敏度可达＜5 copies/反应。

• 不同批次的试剂不能交叉使用。
  
• ROX Reference Dye溶液用于对实时定量PCR或RT-PCR中的荧光报告基因信号进行标准化。不同仪器ROX推荐使用量不同：
  
  • 使用ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT and 7900HT Fast，ABI Step One，ABI Step One Plus时，每个反应（以25μL/反应为例）推荐使用量为0.3～0.5μL；
    
  • 使用ABI 7500，7500 Fast，Stratagene Mx3000P，Mx3005P，Mx4000，MJ Research Chromo4，OPtcon（II），Corbet Rotor Gene 3000时，每个反应（以25μL/反应为例）推荐使用量为0.03～0.05μL。
    
  • 使用Roche、北京鲲鹏基因Archimed X系列、Bio-Rad的实时荧光定量PCR仪，不必使用ROX Reference Dye溶液。
• 为使每个反应能够精确加入ROX Reference Dye溶液，建议使用前将其用水进行稀释后再使用。荧光染料均存在猝灭问题，注意避开日光和紫外线照射，以减缓荧光猝灭。

• 反应设置：
  
  • 将扩增反应液和酶混合液室温条件下解冻并轻轻涡旋10～15sec以充分混合，短暂离心后备用。
    
  • 准备RNA模板或样本。
    
  • 准备引物/探针混合物。每种引物和探针的最终浓度可在50～900 nM范围内调整，以达到最优的实验结果。
    
  • 确定要准备的反应数量。
    
  • 使用无DNA酶的洁净PCR管或96孔板，在冰浴上配制反应体系：
    

    成分	用量
    扩增反应液	7.5μL
    酶混合液	2.5μL
    ROX Reference Dye	根据仪器的推荐使用量添加
    引物探针混合液	X μL
    模板或样本	Y μL
    无核酸酶水	至25μL

  • 密封PCR管或96孔板并短暂离心，轻轻涡旋震荡，使试剂混匀后，再次短暂离心，避免产生气泡。
• 反应条件：
  
  • 将PCR管或96孔板从冰上转移到PCR扩增仪上，程序设置如下：
    

    反应步骤	循环数	反应温度	反应时间
    逆转录	1	55℃	4min
    预变性	1	95℃	1min
    退火延伸	40~45	95℃	3sec
    		58℃	18sec（采集荧光）

    • 根据不同的检测靶标，选择适当的检测通道。
      
    • 优先适配北京鲲鹏基因Archimed X系列、BIO-RAD CFX Maestro可参考上述反应扩增条件，若使用其它PCR扩增仪，请结合仪器本身及实验结果自行调整反应扩增条件。